17
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Thuốc thử Folin – Merck, Đức.
Tyrosin – Merck, Đức.
Casein – Merck, Đức.
Albumin – Merck, Đức.
Dung dịch Citrat Natri 1%: cân chính xác 1g Citrat Natri pha với nước cất
thành 100ml.
Dung dịch Na
2
HPO
4
1/15M: cân chính xác 5.9690g Na
2
HPO
4
.12H
2
O hòa tan
trong nước cất và định mức cho đủ 250ml.
Dung dịch KH
2
PO
4
1/15M: cân chính xác 0.9072g KH
2
PO
4
hòa tan trong
nước cất và định mức lại cho đủ 100ml.
Dung dịch đệm Sorosen 1/15M, pH 7.6: trộn chung 177ml dung dịch
Na
2
HPO
4
1/15M và 23ml dung dịch KH
2
PO
4
1/15M.
Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong dung dịch đệm
Sorensen cho đến khi tan hoàn toàn rồi định mức lại cho đủ 100ml.
Dung dịch TCA 5%: hòa tan 5g TCA trong nước cho đủ 100ml.
Dung dịch NaOH 0.5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml.
Dung dịch HCl 0.2N: trộn 4.25ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 250ml.
Dung dịch Tyrosin 20 mM/l: khuấy nghiền 1.8119 Tyrosin trong dung dịch
HCl 0.2N vừa đủ 500ml.
Dung dịch Tyrosin chuẩn 1mM/l trong dung dịch HCl 0.2N: pha loãng 5ml
dung dịch Tyrosin 20mM/l trong dung dịch HCl 0.2N thành 100ml.
Nhựa đu đủ lấy mẫu tại thị trấn Xuyên Mộc - tỉnh Bà Rịa Vũng Tàu.
18
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Bánh dầu đậu phộng lấy mẫu tại chợ Lái Thiêu.
2.1.2. Thiết bị
Máy quang phổ UV Aglient 8453.
Máy đông khô chân không Christ, Alpha 1- 2 Ldplus
Cùng các thiết bị khác của phòng thí nghiệm : máy ly tâm, máy khuấy từ gia
nhiệt
2.2 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN
2.2.1 Phƣơng pháp trích nhựa đu đủ từ trái
[3, 8, 11, 16, 10, 20]
Quả: lấy ở những quả đang còn xanh, vỏ quả mịn, có trọng lượng từ 0.3-1 kg
là tốt nhất. Quả non quá cho ít nhựa, quả quá già hoặc quả to vừa cho nhựa ít, vừa
không sánh sệt, hoạt tính enzyme không cao. Quả có vỏ sần sùi, chia thùy cũng cho
ít nhựa. Để thu enzyme có hoạt tính cao nhất, nên lấy nhựa ở quả đang độ 10 tuần
tuổi.
Thời gian lấy nhựa: sáng sớm, kết thúc vào giữa buổi sáng (giai đoạn có độ
ẩm không khí cao). Khi độ ẩm không khí thấp, dòng nhựa chảy chậm và đặc rất khó
thu nhận.
Mùa khô: nhựa ít, đặc, nồng độ protein cao
Mùa mưa: nhựa nhiều, loãng, nồng độ protein thấp
Tiến hành
Nhựa đu đủ lấy ở quả xanh còn ở trên cây
Dùng dao inox có đầu nhọn rạch vài đường dọc theo quả ở chỗ đường kính
quả to nhất, các lát khía cách nhau 3-5cm (không rạch sâu quá 2cm, nếu không dịch
nước và tinh bột từ quả sẽ trộn lẫn vào nhựa và làm giảm chất lượng nhựa thu
được).
Hứng lấy nhựa chảy ra bằng lọ thủy tinh màu miệng rộng trong 4 – 6 phút,
sau khi lấy nhựa xong đậy nắp kín và bảo quản lạnh, giữ trong tối nhằm tránh không
cho nhựa tiếp xúc lâu với không khí và để bảo đảm hoạt tính của papain có trong
nhựa.
19
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Khi lấy nhựa cần lau sạch trái nhằm tránh không cho chất bẩn hoặc côn trùng
lẫn vào.
Không nên trộn nhựa khô với nhựa tươi vì nó làm giảm chất lượng nhựa.
Hình 2.1 Cách lấy nhựa đu đủ
Quả có thể được rút nhựa trong suốt khoảng thời gian từ 4 – 7 ngày. Lần đầu
tiên có thể chỉ cần một rạch là đủ, ở những lần thu nhựa sau, rạch 2 – 3 đường giữa
những đường rạch trước đó.
Khi tiến hành các thao tác với nhựa tươi, tránh không cho nhựa tiếp xúc vào
da vì dễ gây bỏng. Đồng thời cũng không nên để nhựa tiếp xúc với các dụng cụ làm
từ kim loại nặng như sắt, đồng, …để tránh làm biến màu và giảm hoạt tính enzyme.
Lọ, dao, muỗng,… phải được làm bằng nhựa hoặc thép không rỉ.
Nhựa tươi không bền vì thế nên đông khô chân không ngay sau khi thu nhận,
nhựa đông khô được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu.
2.2.2 Phƣơng pháp thu nhận papain tinh khiết
[8, 18, 23, 28, 40, 42, 44]
Trong thành phần của nhựa đu đủ tươi ngoài enzyme papain, chymopapain
còn có một số loại enzyme, protein, chất nhựa, chất cao su, chất béo,… và các tạp
chất khác. Để có được quy trình tách và làm sạch papain từ nhựa đu đủ có hiệu quả
thì phải có quy trình hòa tan nhựa đu đủ, mục đích là để loại bỏ các chất cặn, nhựa,
tạp lớn.
20
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Trộn 180g nhựa đu đủ khô với 100g celite và 150g cát sạch, nghiền kỹ trong
cối ở nhiệt độ phòng với 200-300ml dung dịch cysteine 0.04M (hòa tan 6.3g
cysteine hydrochloride trong 1000ml dung dịch NaOH 0.054M, kiềm được sử dụng
để đưa pH dịch chiết tới 5.7). Khi dịch nhựa tạo thành thể huyền phù, gạn bỏ lớp
nổi ở trên. Quá trình nghiền và trích được lặp lại với 300ml dung dịch cysteine. Sau
đó rửa cối với dung dịch cysteine để điều chỉnh thể tích lên 1000ml. Dịch huyền
phù sau cùng được lọc lạnh (có thể hút nhẹ) trên giấy lọc Whatman số 1. Thời gian
lọc phụ thuộc vào nhựa khô được sử dụng và quá trình này có thể rất chậm. Nước
lọc có màu trắng sữa hoặc vàng xanh, pH gần 5.7. Các bước còn lại của quá trình
tinh sạch enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh.
[25, 27, 28]
2.2.2.1 Loại bỏ các chất không tan ở pH 9.
Dịch chiết thu được ở trên được điều chỉnh lên pH 9 bằng cách thêm từ từ và
khuấy đều một lượng khoảng 110ml dung dịch NaOH 1M. Tủa xám tạo thành có
thể được loại ra bằng lọc hoặc ly tâm ở 4000rpm trong 30 phút. Dịch trích ở giai
đoạn này phải trong do các tủa gây biến tính protein đã được loại bỏ.
2.2.2.2 Quá trình phân đoạn bằng amonium sulfate
Cho amonium sulfate vào dịch enzyme đến 40% độ bão hòa, sau 1-2 giờ, ly
tâm ở 4000rpm. Thu nhận tủa, bỏ dịch lỏng hoặc có thể giữ lại để lấy chymopapain.
Tủa được rửa một lần với 400-500ml dung dịch amonium sulfate 40% độ bão hòa.
2.2.2.3 Quá trình phân đoạn bằng NaCl
Hòa tan tủa trong 600ml dung dịch cysteine 0.02M (pH 7-7.5), tủa papain tạo
thành khi thêm từ từ 60g NaCl rắn. Sau một giờ, ly tâm ở 4000rpm trong 40 phút để
thu tủa, bỏ dịch lỏng.
2.2.2.4 Kết tinh
Tủa được tạo thành dịch huyền phù với 400ml dung dịch cysteine 0.002M ở
pH 6.5 và điều kiện nhiệt độ phòng. pH của dung dịch huyền phù được điều chỉnh
lại đến 6.5 sau khi cho protein vào. Giữ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút để tinh thể
tạo thành, sau đó duy trì ở 4
o
C qua đêm, sau đó ly tâm lạnh ở 4000rpm trong 1 giờ
để thu nhận tinh thể.
21
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
2.2.2.5 Tái kết tinh
Hòa tan tinh thể thu được ở giai đoạn kết tinh trong nước cất (tạo dung dịch
có nồng độ protein khoảng 1%) ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho vào từ từ (đồng thời
khuấy đều) dung dịch NaCl bão hòa (10ml/300ml dung dịch protein). Khi 75% thể
tích dung dịch NaCl đã cho vào, papain bắt đầu kết tinh ở nhiệt độ phòng. Dịch
huyền phù được giữ ở 4
o
C qua đêm, sau đó ly tâm thu tủa. Hoạt độ riêng của
enzyme có thể tăng nhẹ nếu tiến hành tái kết tinh thêm một lần nữa như trên.
2.2.2.6 Đông khô chân không.
Tủa protein thu được đem đông khô chân không để loại bỏ nước. Protein sau
khi đông khô chân không được bảo quản trong tủ lạnh để tiến hành các nghiên cứu
tiếp theo.
Qui trình thu nhận papain tinh khiết có thể được tóm tắt lại theo sơ đồ
2.2
Hình 2.2 Sơ đồ thu nhận papain từ nhựa đu đủ đông khô
22
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
2.2.3 Xác định lƣợng protein theo phƣơng pháp Lowry
[1, 4, 12, 36]
Nguyên tắc
Hầu hết các protein đều có chứa tyrosin và tryptophan. Hàm lượng của
những acid amin này tùy thuộc vào loại protein. Vì vậy, những protein cùng loại với
nhau có hàm lượng các acid amin này giống nhau.
Khi cho protein tác dụng với thuốc thử Folin sẽ tạo thành một phức chất có
màu. Cường độ màu của phức này tỉ lệ với hàm lượng tyrosin và tryptophan (cũng
là hàm lượng protein). Vì thế ta có thể dùng phương pháp so màu để xác định hàm
lượng protein.
Hóa chất
Dung dịch A: cân 2g Na
2
CO
3
hòa tan trong NaOH N/10 thành 100ml.
Dung dịch B: cân 0.5g CuSO
4
.5H
2
O hòa tan trong Citrat Natri 1% tạo thành
100ml.
Dung dịch C (chỉ pha để dùng trong ngày): là hỗn hợp của hai dung dịch A
và B được pha theo tỷ lệ 49:1.
Dung dịch Albumin 0.1%: cân chính xác đến 4 chữ số khoảng 0.1g albumin
pha với nước cất thành 100ml.
Dựng đƣờng chuẩn
Ta thực hiện đường chuẩn với một loại protein tinh khiết có sẵn, thường là
albumin của bò đã đông khô. Tiến hành pha albumin có nồng độ khác nhau vào các
ống nghiệm được đánh số từ 0 đến 5 như bảng bên dưới.
Ống nghiệm số 0 1 2 3 4 5
Nồng độ protein mg/ml 0 50 100 150 200 250
Dung dịch albumin 0.1% (ml) 0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
Nước cất (ml) 10 9.5 9.0 8.5 8.0 7.5
Hút 0.4ml dung dịch protein có nồng độ khác nhau từ các ống nghiệm vừa
pha ở trên theo thứ tự từ 1 đến 6 vào 6 ống nghiệm sạch khác. Thêm vào đó 2ml
dung dịch C. Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó thêm vào
0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 – 10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml. Đem
23
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 750nm. Sau đó vẽ đường chuẩn biểu diễn sự
biến thiên của mật độ quang (OD) theo nồng độ albumin chuẩn (mg/ml).
Xác định hàm lƣợng protein có trong mẫu:
Hút 0.4ml dung dịch protein cần xác định hàm lượng cho vào một ống
nghiệm sạch và đã được sấy khô. Thêm vào đó 2ml dung dịch C. Lắc đều và để yên
ở nhiệt độ phòng trong 5 phút. Sau đó, thêm vào 0.2ml thuốc thử Folin, lắc đều
trong 5 – 10 phút, thêm nước cất vào cho đủ 5ml. Đem đo mật độ quang (OD) ở
bước sóng 750nm. Dựa vào đường chuẩn để ngoại suy ra hàm lượng protein có
trong mẫu nghiên cứu.
2.2.4 Xác định hoạt tính protein theo phƣơng pháp Anson
[1, 4]
Nguyên tắc
Casein bị phân giải trong môi trường kiềm dưới tác dụng của protease tạo
thành sản phẩm là các đoạn peptid ngắn hòa tan trong tricloroacetic acid (TCA), xác
định tyrosin và tryptophan hòa tan bởi thuốc thử Folin.
Dựng đƣờng chuẩn Tyrosin
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
Dung dịch Tyrosin chuẩn (ml) 1 2 3 4 5 6
Lượng Tyrosin tương ứng (M)
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Dung dịch HCl 0.2N (ml) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
Dung dịch NaOH 0.5N (ml) 5.0 4.8 4.6 4.4 4.2 4.0
Lắc mạnh, sau 10 phút đo OD ở bước sóng 720nm
Ống số 1 là ống thử không (TK), các ống còn lại là ống thí nghiệm (TT). Vẽ
đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và độ hấp thu quang ở
bước sóng 720nm.
Vẽ đường chuẩn Tyrosin tương quan giữa lượng Tyrosin (M) và OD.
Xác định lƣợng Tyrosin trong dung dịch nghiên cứu
Cân chính xác 0.1g mẫu protein hòa tan trong 100ml nước cất, tạo thành
dung dịch protein có nồng độ 0.001g/ml.
24
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Dung dịch hóa chất Ống nghiệm
1 2
Dung dịch casein 1% (ml) 5 5
Dung dịch TCA 5% (ml) 0 10
Dung dịch enzyme mẫu (ml) 1 1
Lắc đều và giữ ở 35.5
o
C
Dung dịch TCA 5% (ml) 10 0
Để yên 30 phút, lọc lấy dịch bên dưới
Lấy 4 ống nghiệm mới, sạch, chia thành hai lô, mỗi lô hai ống để lấy trung
bình đánh dấu A và B. Cho vào ống A 5ml dịch lọc từ ống nghiệm 1 và ống B 5ml
dịch lọc từ ống nghiệm 2.
Thêm vào mỗi ống 10ml dung dịch NaOH 0.5N và 3ml thuốc thử Folin, lắc
mạnh, sau 10 phút, đo OD ở bước sóng 660nm hoặc 720nm. Dựa vào đồ thị chuẩn
để suy ra được M Tyrosin.
2.2.5 Xác định đạm tổng số theo phƣơng pháp Kjeldahl
[1, 4]
2.2.5.1 Nguyên tắc:
Chất đạm khi đem vô cơ hóa sẽ chuyển thành dạng ammonium sulfat, khi
cho tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac theo
phương trình như sau:
(NH
4
)
2
SO
4
+ NaOH > 2NH
3
+ H
2
O + Na
2
SO
4
Lượng amoniac phóng thích ra sẽ được hơi nước lôi cuốn bằng một dụng cụ
là máy Parnas – Wargner và được dẫn đến một bình tam giác có chứa một lượng
thừa H
2
SO
4
. Từ đây, cho phép chúng ta xác định được lượng amoniac phóng thích
ra, có nghĩa là xác định hàm lượng đạm trong mẫu nguyên liệu.
2NH
3
+ H
2
O + H
2
SO
4
> (NH
4
)
2
SO
4
+ H
2
O
2.2.5.2 Cách tính:
N = 1.4*V (mg/ml)
Trong đó:
25
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
N: Số gam đạm tổng số có trong 1 lít nguyên liệu loãng hay 1kg nguyên liệu
rắn.
V = V
0
– V
V
0
: thể tích NaOH N/100 mẫu thử không.
V: thể tích NaOH N/100 mẫu thử thật.
2.2.6 Phƣơng pháp xác định đạm formol (phƣơng pháp Sorensen)
[1, 4]
2.2.6.1 Nguyên tắc
Trong phân tử acid amin, peptid, protein có một đầu chức là nhóm –COOH
như là một acid còn đầu kia là nhóm –NH
2
được xem như là một base, còn các amin
tự do cũng như amoniac khi hòa tan thường ở dưới dạng amonium NH
4
+
kết hợp với
một anion thường là clorur, sulfat, phosphat…
Như vậy khi ta cho tác dụng các phân tử “phi protein” này với formol,
formol sẽ tác dụng lên nhóm -NH
2
để tạo thành phức chất methylen (mono, tri hoặc
hexamethylen).
HOOC C
R
NH
2
H
+
HCHO HOOC C
R
N
H
CH
2
+
H
2
O
+
HCHO R N CH
2
+
H
2
O
RNH
4
+
Cl
-
+ HCl
Sản phẩm của phản ứng là hợp chất methylen và một chức –COOH tự do
(trong trường hợp acid amin) hoặc HCl (trong trường hợp amin tự do hoặc
amoniac). Nên ta có thể định phân bằng NaOH, từ đây cho phép ta xác định một
cách gián tiếp được lượng –NH
2
.
Khi hàm lượng đạm formol không tăng theo thời gian có nghĩa là phản ứng
thủy phân đã kết thúc
2.2.6.2 Tiến hành
Trung hòa formol ½: lấy 50ml formol ½, thêm vào đó vài giọt
phenolphtalein 3%, cho NaOH N/10 từng giọt cho đến khi dung dịch chuyển màu
hồng nhạt, ta được formol ½ đã trung hòa.
26
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
Hút 10ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng từ 5 đến 20 lần (trong đề tài
này chúng tôi tiến hành pha loãng mẫu 10 lần) thêm vào đó 10ml dung dịch formol
½ đã trung hòa và vài giọt phenolphtalein 3%, lắc đều để phản ứng xảy ra hoàn
toàn, sau đó định phân bằng NaOH x N/10 cho đến khi dung dịch chuyển màu
hồng.
Thực hiện ba sự thử thật và ba sự thử không (thay dung dịch đạm bằng nước
cất) lấy trị số trung bình.
2.2.6.3 Cách tính
Số gam đạm formol có trong 1 lít nguyên liệu = 1.4*V (g/lít)
Trong đó:
V = V – V
0
V
0
: thể tích NaOH N/10 mẫu thử không.
V: thể tích NaOH N/10 mẫu thử thật.
2.2.7 Xác định đạm amoniac
[1, 4]
2.2.7.1 Nguyên tắc
Trong nguyên liệu chứa đạm thường có một loại đạm nằm dưới dạng “vô cơ”
(muối amonium hay những amin dễ bay hơi). Đây là dạng đạm tạo thành do sự
phân hủy của protein (bị lên men thối hoặc quá trình khử carboxyl của acid amin),
vì thế nếu đứng về khía cạnh dinh dưỡng thì loại đạm này không cần cho cơ thể,
nếu có sự hiện diện của nó với hàm lượng cao thì nguyên liệu được đánh giá là “mất
phẩm chất’.
Những loại đạm này thường có tính kiềm yếu, vì vậy khi cho tác dụng với
MgO thì những loại đạm này sẽ bị đuổi ra khỏi dung dịch, nên chúng sẽ được lôi
cuốn theo hơi nước qua một bình đựng lượng thừa acid. Sau đó đem định phân
lượng acid dư, cho phép chúng ta xác định được loại đạm này.
2(NH
4
)
+
+ Mg(OH)
2
> 2NH
3
+ 2H
2
O + Mg
2+
2NH
3
+ H
2
SO
4
> (NH
4
)
2
SO
4
27
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
2.2.7.2 Tiến hành
Lấy 50ml dung dịch nguyên liệu đã pha loãng 20 lần (hoặc cân chính xác
một lượng m gam nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho đồng nhất) cho vào trong bình
cầu 500ml, thêm vào đó 150ml nước cất và vài giọt phenolphtalein, tiếp tục thêm
vào bình cầu 5g MgO, dung dịch phải có màu hồng nhạt, đậy nút ngay để tránh
amoniac bay ra, lắc đều, đun sôi và hơi nước được chưng cất sang một bình tam
giác có chứa sẵn 10ml H
2
SO
4
N/10 và vài giọt thuốc thử Tashiro, đầu nhọn của ống
sinh hàn nhúng chìm trong dung dịch H
2
SO
4
N/10. Chưng cất trong 15-20 phút kể
từ khi dung dịch trong bình cầu sôi. Sau 15-20 phút chất đạm amoniac sẽ được hấp
thụ vào dung dịch H
2
SO
4
. Lấy bình tam giác ra (rửa đầu ống sinh hàn trước khi lấy
ra).
Định phân lượng acid dư bằng NaOH có chuẩn độ là x N/10 từ màu xanh tím
sang màu xanh xám, nếu dư NaOH thì chuyển thành màu xanh ve chai. Thực hiện
ba lần thử thật và ba lần thử không.
2.2.7.3 Cách tính
Số gam đạm NH
3
có trong 1 lít nguyên liệu = (1.4*V)/2.5
V = (V
t
– V
0
) là lượng NaOH tương đương với lượng đạm phóng thích đã
được hấp thụ trong H
2
SO
4
.
2.2.8 Phƣơng pháp chung tiến hành phản ứng thủy phân bánh dầu đậu phộng
với xúc tác papain thô.
[15, 27]
2.2.8.1 Phƣơng pháp loại béo:
Sử dụng dung môi eter dầu hỏa: cho dung môi vào bánh dầu đậu phộng đã
xay nhuyễn với tỷ lệ khối lượng dung môi trên cơ chất là 3:2. Khuấy đều trong 3
giờ ở 70
o
C, sau đó lọc bỏ dung môi (tiến hành 3 lần). Sau đó cho nước vào với tỷ lệ
trên sản phẩm là 2:1, khuấy đều, đem lọc. Thực hiện sự rửa này 7 lần. Sản phẩm thu
được đem sấy khô ta được bánh dầu đậu phộng đã loại béo.
2.2.8.2 Phƣơng pháp thực hiện phản ứng
[5, 30, 31, 37]
Phản ứng thủy phân được thực hiện tại tỉ lệ của bánh dầu đậu phộng với
dung dịch đệm phosphate là 1:10. Cân 5g bánh dầu đậu phộng đã loại béo cho vào
28
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC CHIÊM LÂM PHÚC DIỄM
erlen 100ml, thêm vào 50ml dung dịch đệm phosphate 0.1M. Bánh dầu đậu phộng
được trộn với dung dịch đệm phosphate để đạt được pH mong muốn, hỗn hợp sau
đó được gia nhiệt và khuấy từ liên tục. Khi phản ứng đạt đến nhiệt độ cần khảo sát,
cho enzyme vào với tỉ lệ thích hợp, phản ứng được tiến hành trong 26 giờ. Sau mỗi
2 giờ phản ứng, lấy 0.1 gam dịch thủy phân từ erlen trên, thêm nước sôi để ngừng
phản ứng, định mức thành 100ml dung dịch, đem lọc. Hút 10ml dịch lọc đem xác
định hàm lượng đạm formol theo phương pháp Sorensen, phần dung dịch còn lại
trong bình định mức dùng để xác định lượng protein theo phương pháp Lowry.
2.2.8.3 Hiệu suất thủy phân
[39]
Papain có tính chất của endopeptidase thủy phân protein trong bánh dầu đậu
phộng chủ yếu thành peptide theo phản ứng sau:
R
1
N C
H
H
R
3
C
O
N
H
C
R
4
C
H
R
2
O
HOH
+ N C
H
H
R
3
C
O
R
1
OH
H
2
N C
R
4
CO R
2
H
+
Ngoài ra, papain còn có tính chất của exopeptidase thủy phân các peptide
thành các acid amin theo phản ứng sau:
H
2
N C
H
R
2
C
O
N
H
C
R
3
C
H
R
1
O
HOH
+
H
2
N C
H
R
3
C
O
OH
H
2
N C
R
4
CO R
1
H
+
Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%) được tính dựa trên tỉ lệ hàm
lượng acid amin hòa tan trong nước của dung dịch sau phản ứng so với hàm lượng
protein ban đầu được xác định thông qua hàm lượng nitơ tổng.
Hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân H(%) được tính theo công thức
như sau:
100*
P
G
H
Trong đó:
H: hiệu suất gần đúng của phản ứng thủy phân (%).
Không có nhận xét nào:
Đăng nhận xét