ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN RỪNG DENDROBIUM THU THẬP TẠI TỈNH BÌNH PHƢỚC VÀ THỊ XÃ BẢO LỘC (TỈNH LÂM ĐỒNG) BẰNG KỸ THUẬT RAPD

LINK DOWNLOAD MIỄN PHÍ TÀI LIỆU "ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA GIỐNG LAN RỪNG DENDROBIUM THU THẬP TẠI TỈNH BÌNH PHƢỚC VÀ THỊ XÃ BẢO LỘC (TỈNH LÂM ĐỒNG) BẰNG KỸ THUẬT RAPD": http://123doc.vn/document/554283-danh-gia-da-dang-di-truyen-cua-giong-lan-rung-dendrobium-thu-thap-tai-tinh-binh-ph-oc-va-thi-xa-bao-loc-tinh-lam-dong-bang-ky-thuat-rapd.htm

v


SUMMARY

LE TRAN PHUC KHOA, Nong Lam University, Ho Chi Minh City. September,
2007. “Revealing genetic diversity of wild Dendrobium orchid at Binh Phuoc
province and Bao Loc town (Lam Dong province) by RAPD technique”
Genetic diversity of wild Dendrobium orchid collected from Binh Phuoc
province and Bao Loc town was studied base on RAPD marker to set up the
scientific premise for orchid breeding. The phylogenic dendrogram of 20 tested
wild Dendrobium was produced base on RAPD polymorphic bands by using
NTSYSpc 2.1 and Winboot solfwares. Cluster analysis based on Dice similarity
coefficient matrix were produced using the unweighted pair – group method with
arithmetic average (UPGMA) to group all the studied species. Six from ten RAPD
primer (OPAC10, OPB01, S1384, OPB08, U693, OPAH13) produced a total of 55
polymorphic bands, sized from 180 bp to 3000 bp. The resulting dendrogram
confirmed that species could be distinguished and clustered into two main group
and one auxiliary group. This result indicated that there was a significant genetic
variation among the studied species.

vi

MỤC LỤC

CHƢƠNG TRANG
Trang tựa i
Lời cảm tạ iii
Tóm tắt iv
Summary v
Mục lục vi
Danh sách các bảng ix
Danh sách các hình x
Danh sách các chữ viết tắt xi
CHƢƠNG 1. MỞ ĐẦU 1
1.1. Đặt vấn đề 1
1.2. Mục đích – yêu cầu đề tài 2
1.2.1. Mục đích 2
1.2.2. Yêu cầu 2
1.3. Giới hạn đề tài 2
CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1. Giới thiệu về cây hoa lan 3
2.1.1. Nguồn gốc và phân bố các loài phong lan. 3
2.1.2. Các đặc tính chủ yếu của loài lan ký sinh 4
2.1.3. Giới thiệu chung về giống lan Dendrobium 7
2.1.3.1. Đặc điểm hình thái 8
2.1.3.2. Điều kiện sinh thái 9
2.1.4. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới và ở Việt Nam 9
2.1.4.1. Tình hình sản xuất hoa lan trên thế giới 9
2.1.4.2. Tình hình sản xuất hoa lan ở Việt Nam 10
2.2. Giới thiệu về đa dạng sinh học 12
2.2.1. Định nghĩa 12

vii

2.2.2. Các phân mức về đa dạng sinh học 12
2.2.2.1. Sự đa dạng về hình thái 12
2.2.2.2. Đa dạng loài 12
2.2.2.3. Sự đa dạng về di truyền 13
2.3. Một số phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng di truyền 14
2.3.1. Phƣơng pháp sử dụng các marker hình thái 14
2.3.2. Phƣơng pháp sử dụng các marker isozyme 14
2.3.3. Phƣơng pháp sử dụng các marker phân tử 15
2.4. Quy trình ly trích DNA tế bào thực vật 15
2.5. Kỹ thuật PCR 17
2.5.1. Khái niệm và nguyên tắc của kỹ thuật PCR 17
2.5.2. Thành phần phản ứng PCR 19
2.5.3. Ƣu, nhƣợc điểm của kỹ thuật PCR 20
2.6. Một số marker phân tử thƣờng dùng trong nghiên cứu đa dạng di truyền 21
2.6.1. Marker RFLP 22
2.6.2. Marker AFLP 22
2.6.3. Marker RAPD 23
2.6.4. Marker SSR 25
2.7. Cây phát sinh loài 26
2.7.1. Một số thuật ngữ 26
2.7.2. Những cách vẽ cây phát sinh loài 26
2.7.3. Các phƣơng pháp chủ yếu tạo cây phát sinh loài 27
2.8. Các công trình nghiên cứu khoa học có liên quan 27
2.8.1. Tình hình nghiên cứu khoa học trên cây lan ngoài nƣớc 27
2.8.2. Tình hình nghiên cứu khoa học trên cây lan trong nƣớc 28
CHƢƠNG 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP TIẾN HÀNH 30
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện 30
3.2. Vật liệu 30
3.2.1. Các loài lan rừng giống Dendrobium 30

viii

3.2.2. Hóa chất thí nghiệm 34
3.2.3. Trang thiết bị thí nghiệm 35
3.3. Phƣơng pháp 36
3.3.1. Quy trình ly trích DNA tổng số 36
3.3.2. Kiểm tra định tính và định lƣợng DNA 37
3.3.2.1. Định tính DNA bằng phƣơng pháp điện di 37
3.3.2.2. Định lƣợng DNA bằng phƣơng pháp đo OD 38
3.3.3. Tối ƣu hóa các thành phần phản ứng PCR với marker RAPD 38
3.3.4. Thực hiện phản ứng PCR với marker RAPD 42
3.3.5. Phƣơng pháp đánh giá mối quan hệ di truyền bằng phần mềm NTSYS . 43
3.3.6. Phân tích Boostrap bằng phần mềm Winboot 44
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 45
4.1. Sản phẩm ly trích DNA tổng số 45
4.2. Hoàn thiện quy trình PCR với marker RAPD 48
4.3. Đánh giá đa dạng di truyền của 10 loài lan rừng giống Dendrobium
thu thập tại tỉnh Bình Phƣớc và thị xã Bảo Lộc tỉnh Lâm Đồng 52
4.3.1. Sản phẩm PCR với marker RAPD 52
4.3.2. Phân tích nhóm của 10 loài lan rừng giống Dendrobium
dựa trên dữ liệu RAPD 58
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 65
5.1. Kết luận 65
5.2. Đề nghị 65
TÀI LIỆU THAM KHẢO 67
PHỤ LỤC

ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 3.1 Danh sách các loài lan rừng giống Dendrobium nghiên cứu 30
Bảng 3.2 Danh sách các primer dùng trong nghiên cứu 35
Bảng 3.3 Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng PCR 38
Bảng 3.4 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR 39
Bảng 3.5 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của số chu kỳ đến sản phẩm RAPD 39
Bảng 3.6 Thành phần phản ứng PCR dùng trong thí nghiệm 1 40
Bảng 3.7 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer đến sản phẩm
RAPD 40
Bảng 3.8 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg
2+
đến sản phẩm
RAPD 41
Bảng 3.9 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq

đến sản phẩm
RAPD 41
Bảng 3.10 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu đến
sản phẩm RAPD 42
Bảng 3.11 Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ dNTPs đến sản phẩm
RAPD 42
Bảng 4.1 OD của 20 mẫu dùng để thực hiện phản ứng PCR với marker RAPD 47
Bảng 4.2 Nồng độ tối ƣu các thành phần của phản ứng PCR 52
Bảng 4.3 Chƣơng trình nhiệt tối ƣu cho phản ứng PCR 52
Bảng 4.4 Danh sách các primer đƣợc sử dụng để nghiên cứu đa dạng
di truyền của 10 loài lan rừng giống Dendrobium 53
Bảng 4.5 Hệ số tƣơng đồng di truyền của các loài lan rừng giống
Dendrobium khảo sát 58


x

DANH SÁCH CÁC HÌNH

HÌNH TRANG
Hình 2.1 Nguyên tắc cơ bản của phản ứng PCR 18
Hình 2.2 Nguyên tắc của kỹ thuật RAPD 24
Hình 3.1 Các loài lan rừng giống Dendrobium nghiên cứu 33
Hình 4.1 DNA tổng số của 10 loài lan rừng giống Dendrobium ở Bảo Lộc 46
Hình 4.2 DNA tổng số của 10 loài lan rừng giống Dendrobium ở Bình Phƣớc 46
Hình 4.3 Khảo sát ảnh hƣởng của số chu kỳ 49
Hình 4.4 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ primer 49
Hình 4.5 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Mg
2+
50
Hình 4.6 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ Taq 50
Hình 4.7 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ DNA mẫu 51
Hình 4.8 Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ dNTPs 51
Hình 4.9 Sản phẩm PCR với primer OPAC10 của 10 mẫu lan thu thập ở
Bảo Lộc (hình a) và Bình Phƣớc (hình b) 55
Hình 4.10 Sản phẩm PCR với primer OPB01 của 10 mẫu lan thu thập ở
Bảo Lộc (hình a) và Bình Phƣớc (hình b) 56
Hình 4.11 Sản phẩm PCR với primer S1384 của 10 mẫu lan thu thập ở
Bảo Lộc (hình a) và Bình Phƣớc (hình b) 57
Hình 4.12 Cây phân nhóm di truyền giữa 10 loài lan rừng giống
Dendrobium thu thập tại tỉnh Bình Phƣớc và thị xã Bảo Lộc 60
Hình 4.13 Đồ thị phân bố nhóm dựa trên dữ liệu RAPD 61


xi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism
Bp: base pairs

CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide
DAF: DNA amplification fingerprinting

dNTP:

Deoxyribonucleotide triphosphate
EB: extraction buffer

EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid
GH: Giả Hạc
KĐ: Kim Điệp
LN: Long Nhãn
LT: Long Tu
NĐH: Nhất Điểm Hoàng
NTSYS: Numercial Taxonomy System
OD: Optical density

OTU: Operational Taxonomic Units
PCI: Phenol : Chloroform : Isoamylalcohol (25 : 24 : 1)

PCR: Polymerase Chain Reaction
PVP: Polyvidon
RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism
SDS : Sodium Dodecyl Sulfat
SSCP: Single – Strand Conformation Polymorphism
SSR: Simple Sequence Repeat
T
a
: Annealing temperature
TAE: Tris – Acetate – EDTA

TB: Thái Bình
TE: Tris – EDTA

xii

T
m
: Melting temperature
TT: Thủy Tiên
TTV: Thủy Tiên Trắng Vàng
TV: Thủy Tiên Vàng
UPGMA: Unweighted Pair Group Method with Arithmetic
VR: Vẩy Rồng
WWF: World Wildlife Fund (quỹ quốc tế về bảo tồn thiên nhiên)


1


Chƣơng 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Hoa lan là một món quà của tạo hóa, nó không chỉ là một loài hoa đẹp có giá
trị về mặt tinh thần mà còn có giá trị kinh tế cao và hiện đang có thị trƣờng tiêu thụ
mạnh trong nƣớc cũng nhƣ xuất khẩu. Ngày nay, chúng ta có thể thấy hoa lan ở
khắp mọi nơi và dễ bị choáng ngợp trƣớc vẻ đẹp quyến rũ, biến hóa muôn màu,
muôn vẻ của các loài hoa nhƣ: Cattleya, Hồ Điệp, Dendrobium, Vanda, Cymbidium.
Hoa lan đƣợc ƣa chuộng phải chăng bởi đó là biểu tƣợng của niềm khao khát cuộc
sống phong lƣu và hạnh phúc bền bỉ.
Ở vùng nhiệt đới, đặc biệt là tỉnh Bình Phƣớc và thị xã Bảo Lộc (tỉnh Lâm
Đồng) phù hợp với nhiều loại phong lan, địa lan. Ngoài việc nhập nội, lai tạo, nhân
giống các loại lan mới, chúng ta còn sở hữu nhiều nguồn gen quý hiếm, độc đáo,
mới lạ. Hơn nữa, các giống lan thƣơng mại hiện nay tại Việt Nam đều là những
giống lan lai (có nguồn gốc từ Thái Lan, Đài Loan, Singapore và Trung Quốc) làm
cho tình hình giống ngày càng trở nên phức tạp. Vì vậy, trƣớc hết chúng ta cần phải
tiến hành khảo sát tính đa dạng di truyền các giống lan địa phƣơng, trên cơ sở đó
thực hiện có hiệu quả việc nhân và tạo giống mới cho chất lƣợng tốt, đồng thời xây
dựng các định hƣớng về kiểm tra, quản lý và bảo vệ nguồn gen các giống lan sẵn có
trong nƣớc.
Để nghiên cứu đa dạng di truyền ngƣời ta có thể sử dụng nhiều phƣơng pháp
khác nhau: phƣơng pháp sử dụng các marker hình thái, marker isozyme hay marker
phân tử (RFLP, RAPD, AFLP, SSR, SSCP). Tùy vào đối tƣợng, điều kiện và mục
đích nghiên cứu mà lựa chọn phƣơng pháp phù hợp nhất. Trong đề tài này, chúng
tôi tiến hành nghiên cứu tính đa dạng về di truyền của một số loài lan rừng giống
Dendrobium bằng kỹ thuật RAPD vì đây là kỹ thuật đơn giản, cho kết quả nhanh,
và đặc biệt không cần phải biết trƣớc trình tự bộ gen của đối tƣợng nghiên cứu.

2


Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài:
"Đánh giá đa dạng di truyền của giống lan rừng Dendrobium thu thập
tại tỉnh Bình Phƣớc và thị xã Bảo Lộc (tỉnh Lâm Đồng) bằng kỹ thuật RAPD"
1.2. Mục đích - yêu cầu đề tài
1.2.1. Mục đích
Thông qua kỹ thuật RAPD, đánh giá độ đa dạng di truyền của một số loài lan
rừng giống Dendrobium thu thập tại tỉnh Bình Phƣớc và thị xã Bảo Lộc (tỉnh Lâm
Đồng) làm tiền đề phục vụ cho công tác chọn, tạo giống lan.
1.2.2. Yêu cầu
Thành thạo thao tác ly trích DNA tổng số.
Nắm vững kỹ thuật PCR, hạn chế sai sót trong quá trình thực hiện.
Nắm vững các kỹ thuật trong sử dụng marker RAPD.
Hiểu rõ về các phần mềm xây dựng cây phát sinh loài nhƣ NTSYSpc 2.1,
Winboot.
1.3. Giới hạn đề tài
Khóa luận đƣợc thực hiện từ tháng 3 – 2007 đến tháng 8 – 2007 là khoảng
thời gian tƣơng đối ngắn nên kết quả chƣa phản ánh đầy đủ và chính xác.
Chƣa đủ điều kiện để thực hiện trên nhiều primer RAPD để thu đƣợc kết quả
chính xác hơn.
Việc lấy mẫu cá thể cũng là vấn đề trở ngại, ảnh hƣởng đến kết quả phân
tích.